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研究背景
溶瘤病毒（Oncolytic Virus，OV），比如腺病毒、新城疫病毒（NDV）、細(xì)小病毒和呼腸孤病毒等，作為一類能夠選擇性感染和殺死腫瘤細(xì)胞的病毒，同時(shí)激活宿主的抗腫瘤免疫反應(yīng)，在治療惡性腫瘤方面展現(xiàn)出了巨大前景。溶瘤病毒的抗腫瘤作用主要?dú)w因于其在腫瘤細(xì)胞中的優(yōu)先復(fù)制和溶瘤作用，以及溶瘤后激活的免疫反應(yīng)。然而，在臨床實(shí)踐中，溶瘤病毒面臨著幾大挑戰(zhàn)，包括靜脈注射安全性問(wèn)題、免疫原性不足、抗病毒免疫反應(yīng)等。
具體來(lái)說(shuō)，溶瘤病毒在靜脈注射時(shí)可能對(duì)正常組織造成損害，存在安全性問(wèn)題；同時(shí)，病毒引發(fā)的免疫反應(yīng)較弱，難以有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，即免疫原性不足；此外，病毒在體內(nèi)可能引發(fā)中和抗體，導(dǎo)致治療效果減弱，即抗病毒免疫反應(yīng)。這些問(wèn)題限制了溶瘤病毒在臨床上的應(yīng)用。
廣西醫(yī)科大學(xué)趙永祥教授研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種新型溶瘤病毒療法，通過(guò)基因工程改造，提高了溶瘤病毒的免疫原性，增強(qiáng)其抗腫瘤效果，同時(shí)解決了靜脈注射安全性問(wèn)題。
研究思路與方法 1 1. 研究思路 針對(duì)溶瘤病毒在臨床應(yīng)用中存在的問(wèn)題，研究團(tuán)隊(duì)提出了一種創(chuàng)新思路：利用基因工程技術(shù)，將豬源α1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因（α1,3GT）整合到新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）基因組中，構(gòu)建重組新城疫病毒NDV-GT。NDV-GT能夠在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)αGal抗原，讓免疫系統(tǒng)將腫瘤識(shí)別為外來(lái)的豬器官，從而觸發(fā)超急性排斥反應(yīng)，增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。 1 2. 研究方法 2.1 病毒構(gòu)建與表征 研究團(tuán)隊(duì)利用基因工程技術(shù)，將豬源α1,3GT基因整合到NDV基因組中，構(gòu)建NDV-GT病毒。通過(guò)病毒滴定、基因組測(cè)序等方法對(duì)NDV-GT進(jìn)行表征，確保其遺傳穩(wěn)定性和生物安全性。 2.2 臨床前研究 建立人肝癌異種移植模型，通過(guò)超聲引導(dǎo)下經(jīng)靜脈給藥的方式，將NDV-GT病毒注射到模型動(dòng)物體內(nèi)。 利用RayBio的蛋白芯片產(chǎn)品對(duì)腫瘤組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行分析，探索NDV-GT病毒的抗腫瘤機(jī)制。通過(guò)比較不同治療組腫瘤組織中蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異，發(fā)現(xiàn)NDV-GT病毒能夠顯著激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡和清除。 對(duì)NDV-GT病毒的安全性進(jìn)行評(píng)估，包括病毒檢測(cè)、血常規(guī)和生化指標(biāo)檢測(cè)以及組織學(xué)檢查等。 2.3 臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在臨床前研究的基礎(chǔ)上，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)起了一項(xiàng)臨床試驗(yàn)，招募了23名難治性癌癥患者，包括肝癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、食管癌、直腸癌、乳腺癌和黑色素瘤。這些患者每周接受一次NDV-GT靜脈注射，持續(xù)8-12周。通過(guò)PET-CT、CT、MRI等影像學(xué)手段評(píng)估腫瘤的縮小情況，并使用免疫學(xué)指標(biāo)評(píng)估患者的免疫反應(yīng)。
研究結(jié)果分析 1 1. 細(xì)胞與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)： NDV-GT是通過(guò)反向遺傳技術(shù)將豬α1,3-GT基因插入NDV序列生成的，經(jīng)PCR和測(cè)序確認(rèn)基因成功插入且保留復(fù)制能力。實(shí)驗(yàn)顯示，NDV-GT能特異性感染多種腫瘤細(xì)胞（如HepG2、HO8910、HeLa、A549、TE-10、SK-MEL-2、MDA-MB-231、LS513等），并在這些細(xì)胞中有效表達(dá)外源性α1,3-GT基因，同時(shí)對(duì)正常肝細(xì)胞（THLE-2）感染和侵襲性極小。與親本NDV相比，NDV-GT對(duì)腫瘤細(xì)胞（如HepG2）的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)能力更強(qiáng)，這歸因于αGal增強(qiáng)的裂解能力。這些結(jié)果表明NDV-GT具有作為腫瘤治療藥物的潛力。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在CRISPR誘導(dǎo)的食蟹猴肝癌模型中，NDV-GT（新城疫病毒-基因治療型）展現(xiàn)出顯著的溶瘤效果。通過(guò)肝內(nèi)門靜脈注射CRISPR-Cas9誘導(dǎo)肝腫瘤后，靜脈注射NDV-GT，腫瘤內(nèi)綠色熒光細(xì)胞在72小時(shí)達(dá)到峰值，96小時(shí)仍廣泛分布。治療后第三個(gè)月，NDV-GT組腫瘤顯著縮小，停藥3個(gè)月后腫瘤完全消失，所有猴子存活。相比之下，NDV組腫瘤生長(zhǎng)延遲但停藥后反彈，PBS組平均存活時(shí)間僅4個(gè)月。機(jī)制上，NDV-GT誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)血栓形成、血管閉塞及補(bǔ)體沉積，引發(fā)超急性排斥反應(yīng)，并通過(guò)Akt-IKK-NF-kB途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，下調(diào)相關(guān)蛋白磷酸化并上調(diào)胱天蛋白酶。這表明NDV-GT通過(guò)直接裂解腫瘤細(xì)胞、引發(fā)超急性排斥反應(yīng)和激活免疫反應(yīng)實(shí)現(xiàn)腫瘤消退。 fig. 1 2 臨床試驗(yàn)結(jié)果 在23名難治性癌癥患者的臨床試驗(yàn)中，20名患者完成了治療并進(jìn)行了療效評(píng)估。結(jié)果顯示，NDV-GT治療顯著增強(qiáng)了患者的免疫反應(yīng)，包括T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的激活，以及多種細(xì)胞因子的分泌。在疾病控制率（DCR）方面，達(dá)到90%（1例完全緩解，6例部分緩解，11例病情穩(wěn)定）。在安全性方面，NDV-GT治療未引發(fā)嚴(yán)重副作用，患者的中和抗體水平雖有輕微上升，但仍在正常范圍內(nèi)，未影響治療效果。 具體分為四種類型： （1）完全緩解（CR）：1例患者腫瘤完全消失，且持續(xù)4周以上無(wú)復(fù)發(fā)。 （2）部分緩解（PR）：6例患者腫瘤體積縮小超過(guò)30%，且持續(xù)4周以上。 （3）病情穩(wěn)定（SD）：11例患者腫瘤體積縮小不超過(guò)30%或增大不超過(guò)20%，且未出現(xiàn)新的病灶。 （4）疾病進(jìn)展（PD）：2例患者腫瘤體積增大超過(guò)20%或出現(xiàn)新的病灶。 此外，研究團(tuán)隊(duì)還觀察了NDV-GT對(duì)特定腫瘤類型的影響。以原發(fā)性肝細(xì)胞癌（HCC）為例，在接受NDV-GT治療1.5個(gè)月后，患者體內(nèi)的腫瘤結(jié)節(jié)縮小甚至消失，甲胎蛋白（AFP）水平顯著降低，表明腫瘤進(jìn)展受到抑制。此外，對(duì)治療后免疫指標(biāo)的分析表明，NDV-GT增強(qiáng)了適應(yīng)性免疫，重新激活了免疫記憶系統(tǒng)，緩解免疫抑制或免疫逃逸，引發(fā)天然抗腫瘤免疫，并發(fā)揮體液和細(xì)胞免疫療法（fig.5D-5F）。該治療還促進(jìn)了針對(duì)腫瘤的細(xì)胞因子分泌和免疫逃逸，而不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）（fig.5G）。此外，NDV-GT除了炎癥略有增加外，不影響血液指標(biāo)或腎功能，因此表明其生物安全性。重要的是，治療后患者血液中抗NDV中和抗體的滴度略高于治療前，但仍在正常對(duì)照值范圍內(nèi)（fig.5H）。細(xì)胞因子抗體芯片(QAH-INF-3)分析進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞因子的激活，并揭示了激活的細(xì)胞因子參與JAK-STAT信號(hào)通路的正向調(diào)節(jié)，該通路調(diào)節(jié)病毒蛋白與細(xì)胞因子/細(xì)胞因子受體之間的相互作用（fig.5I-5L）。基于總體反應(yīng)（OR）差異的生存分析表明，NDV-GT有效地治療了快速達(dá)到PR并在10個(gè)月內(nèi)保持穩(wěn)定的HCC患者。 fig. 5 對(duì)P2卵巢癌癥組織的治療后分析顯示，NDV-GT和aGal表達(dá)顯著增殖（fig. 6L）。這種表達(dá)引發(fā)了超急性排斥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)了血栓形成（fig.6M和6N）。此外，腫瘤組織中T淋巴細(xì)胞明顯浸潤(rùn)（fig.6O和6P），導(dǎo)致明顯的級(jí)聯(lián)擴(kuò)增溶瘤反應(yīng)，有助于卵巢腫瘤的成功縮小甚至消失（fig.6A）。此外，根據(jù)imRECIST的評(píng)估，P2表現(xiàn)出持續(xù)12個(gè)月的快速PR，總生存期（OS）達(dá)到17個(gè)月。 fig. 6 此外，針對(duì)惡性黑色素瘤伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者P11，在入組之前，她接受了手術(shù)治療和靶向治療。在接受了為期3個(gè)月的NDV-GT靜脈注射后，產(chǎn)生了4個(gè)月的穩(wěn)定期（fig.4A、4B）。隨后，她接受了手術(shù)以清除剩余的轉(zhuǎn)移瘤。目前，患者已穩(wěn)定超過(guò)32個(gè)月。 fig. 4 3 機(jī)制探討 NDV-GT能夠觸發(fā)超急性排斥反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤血管栓塞和腫瘤壞死。同時(shí)，NDV-GT還能增強(qiáng)免疫反應(yīng)，不僅直接溶解腫瘤細(xì)胞，還通過(guò)激活體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，增強(qiáng)了抗腫瘤效果。這些機(jī)制共同作用于腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了顯著的抗腫瘤效果。 討論與小結(jié) 本研究開發(fā)了一種基于新城疫病毒（NDV）的基因工程溶瘤病毒NDV-GT，通過(guò)引入豬源α1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（a1,3GT）基因，誘導(dǎo)超急性排斥反應(yīng)，顯著增強(qiáng)抗腫瘤免疫。主要發(fā)現(xiàn)如下： 特異性溶瘤效果與安全性：NDV-GT對(duì)腫瘤細(xì)胞具有高度特異性感染和裂解能力，對(duì)正常組織影響極小，顯著提高了治療的安全性和有效性。 超急性排斥反應(yīng)與免疫增強(qiáng)：NDV-GT通過(guò)在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)αGal抗原，觸發(fā)超急性排斥反應(yīng)，激活免疫系統(tǒng)，通過(guò)CDC和ADCC機(jī)制增強(qiáng)抗腫瘤免疫，實(shí)現(xiàn)腫瘤抑制甚至清除。 臨床試驗(yàn)的積極結(jié)果：在多種難治性癌癥患者的臨床試驗(yàn)中，NDV-GT表現(xiàn)出良好療效和安全性，疾病控制率達(dá)90%，部分患者實(shí)現(xiàn)CR或PR，未觀察到嚴(yán)重不良事件。 盡管NDV-GT展現(xiàn)出顯著抗腫瘤效果，但仍面臨挑戰(zhàn)：需優(yōu)化生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制，提高穩(wěn)定性和生物安全性；探索與其他免疫療法的聯(lián)合應(yīng)用；開展更大規(guī)模臨床試驗(yàn)以驗(yàn)證其在更多癌癥類型中的療效和安全性。這些工作將為溶瘤病毒療法的發(fā)展提供新思路，為腫瘤治療帶來(lái)新希望。
